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摘要
2021年8月26日美国化学会（ACS)期刊NANO发表了国家纳米中心聂广军、王海课题组与北京中医药大学东方医院李慧课题组最新的研究成果。论文的题目是“Separable Microneedle Patch toProtect and Deliver DNA Nanovaccines Against COVID-19”。
这是一篇将DNA新冠疫苗做成可溶解微针的最新研究成果，与当前肆虐全球的新冠疫情紧密相关。必赢作为可溶解微针技术产业化的先行者，我们认为这是一篇不可多得的高水平研究文献，下面青澜就和大家一起详细解读这篇文献，并结合公司自己的微针疫苗研发实践，一同认识可溶解微针DNA疫苗技术。
一、DNA疫苗与可溶解微针技术相结合，取得了较好的免疫效果
在2020年初我国国家科技部确定的五条疫苗技术路线中，基因疫苗代表最新的技术路线。在新冠疫情来临之前，全球尚无一款人用的基因疫苗上市，基因疫苗的新颖性可见一斑。基因疫苗又分为mRNA疫苗和DNA疫苗，2020年12月21日辉瑞/BioNtech的mRNA新冠疫苗在欧盟有条件获批上市，这是历史上首个上市用于人体的mRNA疫苗。 DNA疫苗是将抗原蛋白编码的DNA片段通过生物工程大量表达出来，做成具备各种功能段的环状DNA质粒。DNA质粒被递送进入细胞核内转录为RNA，再由后者翻译成抗原蛋白。基因疫苗相当于把抗原的生产过程从医药车间搬到细胞内，基因疫苗能够同时激起机体的体液免疫和细胞免疫。美国NASDAQ上市公司Inovio Pharmaceuticals, Inc.和港股准上市公司苏州艾棣维欣是全球DNA疫苗研发的佼佼者，目前两家合作的DNA新冠疫苗正在全球9个国家开展三期临床试验。
2021年8月20日，印度药物监管机构批准使用DNA新冠肺炎疫苗ZyCoV-D，在近日的临床试验中，该款三剂式的疫苗有效率达66%，成为印度第二种获得批准的国产疫苗。这也是世界上第一种新冠病毒DNA疫苗。有科技媒体调研发现，印度获批的DNA疫苗在序列设计上与艾棣维欣/INOVIO已经发表的临床前研究披露的序列设计高度一致，但是考虑到印度疫情的严重程度，目前未有看到任何一方有相应的知识产权方面的诉求。
聂广军课题组等将最新的DNA疫苗与概念性十足的可溶解微针技术结合，在体外试验和动物试验中都取得了较好的免疫效果。如果可以产业化，将真正地实现“不打针不吃药”即完成疫苗的接种，突破现有技术，实现新的突破。
（图1）
如图1所示，研究者设计的微针贴由三部分构成，分别是载有DNA质粒的针体部分，由温敏材料组成的蓝色中间分离层以及用于承载微针的灰色基膜层。当载有疫苗的微针贴在皮肤上以后，降低温度，蓝色的分离层会逐渐液化（在14摄氏度左右，蓝色中间分离层会液化从而使针体断裂并留在皮肤内），揭掉基膜，即可实现疫苗的接种，设计概念非常巧妙。由于表皮层是抗原呈递细胞（APC，图1中DC即是APC的一种)最丰富的部位，因此也是最好的免疫部位，比肌肉注射更少的疫苗剂量即可实现同等的免疫应答。
二、微针DNA新冠疫苗贴的逻辑和技术难度
根据DNA疫苗的起效原理，只有将DNA疫苗递送进入细胞核才可以发挥作用。如何将DNA疫苗成功递送到细胞核内，是该类疫苗成功研发的关键。微针刺破角质层，将DNA疫苗成功递送到皮肤的组织液，接下来还需要透过细胞膜，完成细胞质中的溶酶体逃逸，穿过细胞核膜才可以到达细胞核。由于机制复杂，基因药物的递送在高校的药剂学教材中，都是作为难度较大药物剂型放在最后介绍。
此外，聂广军课题组还将R848作为DNA疫苗的佐剂，与DNA疫苗进行同步递送。由于R848这个佐剂不溶于水，要想成功完成DNA疫苗的递送并发生效力，需要解决的技术难点多且大。
(图2）
为了完成上述目标，聂广军课题组等巧妙的进行了药物载体设计，如图2所示，采用了PEI纳米颗粒，PEI是阳离子聚合物，表面带有大量正电荷，内部疏水基团刚好用于包裹油溶性的R848佐剂。
PEI纳米颗粒外面可以吸附带负电的DNA质粒。PEI纳米颗粒携带了DNA质粒和佐剂，能够完成透过细胞膜，良好的溶酶体逃逸能力，能最终将DNA质粒和佐剂成功递送进入细胞核内。图2方法制得的DNA纳米粒子溶液与PVA材料组成了图1所示的针体部分，在皮肤上贴敷后，针体部分溶断在皮肤内。包含DNA质粒的纳米颗粒经过细胞的内吞作用，被APC捕获，研究者通过一系列的染色试验，证明了纳米颗粒被细胞成功内吞、转染以及抗原S和N蛋白的表达。作者甚至通过分离提纯，在WESTERN POINT里宏观看到了所表达的S和N蛋白。整个试验设计逻辑严谨，试验结果充分，间接和直接的证据都表明，微针DNA新冠疫苗贴能够在体内成功的实现了免疫。
接下来，我们再通过图3观察一下微针疫苗贴的贴敷过程和贴前贴后微针贴的完整显微照片。
（图3）
我们可以看到，贴敷后的残贴上可以清晰的看到针体断裂后留下的空位。当把载有DNA质粒的针尖液进行红色染料标记时，通过俯视图和平视图，可以清晰的看到针体部分完整无缺失。
微针和性质稳定的DNA疫苗技术结合，做成DNA疫苗微针贴，不需要注射器，徒手就可以贴敷，贴敷过程犹如使用创可贴，而且患者无痛感，极大地提升了患者在接种疫苗的依从性。
为了验证常温下DNA疫苗微针贴的稳定性，研究者做了在室温下的储存试验。结果表明，室温放置几个月的DNA疫苗微针贴，依然能够具有充足的免疫原性。也就是说，DNA疫苗微针贴不需要冷链保存和运输——这对于发展水平低下的国家和地区具有非常重要的现实意义，极大的提升了疫苗在这些地区的可及性。这不仅仅是核酸疫苗开发重大进展，也是整个疫苗领域重大的技术性突破。
此外，作为平行试验组，研究者还做了没有PEI纳米粒子包裹的裸DNA质粒的微针贴，结果没有观察到细胞转染，也没有得到最终的S和N抗原蛋白的表达。研究者认为这体现了PEI纳米颗粒体系对于DNA质粒递送的重要性和必要性。
文章有提到PEI虽然广泛的被用于基因药物的递送，但是它的细胞毒性是潜在应用存在的一个严肃问题。研究者认为降低PEI的分子量会降低它的毒性，但是并不能完全消除它的细胞毒性。必赢注意到在由潘卫三教授主编的全国高等教育药学类规划教材《药剂学》的基因药物递送章节中，也提到了非病毒载体的PEI材料，PEI包裹的DNA质粒具有良好的透过细胞膜和溶酶体逃逸能力。PEI被广泛地用于研究型的细胞转染实验，但是目前尚无含有PEI材料的药物产品得到监管部门的批准。
必赢于2021年2月开始与苏州艾棣维欣合作进行DNA新冠微针贴疫苗的开发，双方的目标是该技术成功的产业化，将产品最终推向市场。
微针概念的提出有几十年了，可溶解微针技术的提出也有近20年的历史，我们经常说微针技术是平台技术，可以广泛的用于药物的递送。然而，当我们具体开展某款药物的微针剂型时，依然是“从0到1”的过程，需要解决的技术问题非常多，难度也非常大。这也是为什么微针技术的发展前景被非常看好、但至今却仍未在药物递送领域真正走向商品化的原因。
综上我们所解读的文献研究内容，我们了解到上述研究递送的目标药物与必赢所递送的目标药物完全一致，这体现了必赢在DNA微针疫苗研究领域的前沿性，同时对我们的产业化研究也有深度的启发。《NANO》是ACS的知名期刊，影响因子（IF）超过17，是国际顶级期刊。在《NANO》上刚刚发表的这项前瞻性研究属于基础研究，横跨了DNA疫苗和可溶解微针两大前沿技术，但是要想实现这项技术的商业化往往是论文发表后若干年的事情。这还不是困难的全部，疫苗的研发和推向市场在解决技术问题的同时，还要满足监管部门的法规要求。
不过好在微针技术是一个结果导向的技术，不管过程有多复杂难度有多大，它的终极目的是为了实现药物递送，让药物发挥作用。不过，在做这个技术研发的过程中，还要同步满足药监部门的法规要求。必赢和艾棣维欣都是商业化的企业，无论面对的项目有多难，双方在决策启动项目之前，目标非常明确，就是尽快实现微针药物递送的产业化。
三、青澜关于微针疫苗的4点思考
由于必赢和艾棣维欣的相关研究尚未发表，因此很多数据和结果尚不能在此公开。青澜的微针研发部分我们只能以点带面，把一些研究结果与大家分享，过程涉及技术秘密，暂时不深入讨论。
在此我们仅就四个问题点进行讨论，但是并不意味着我们需要解决的问题只有这四个方面。
一、接种时间
众所周知，常规注射疫苗在接种后，需要在留置点观察30分钟，如有意外情况便于医务人员及时处置。将疫苗接种方式改为可溶解微针贴以后，如果我们要求接种者留置数个小时，那肯定不能被患者接受，集中接种点也无法容纳那么多的接种者。因此，我们必须把接种时间和留置观察的总时间作为微针疫苗的研发输入条件。
接种时间要与传统肌注相当，再留置观察30分钟。为此聂广军课题组的文章中将微针贴设计成了三层结构，中间的分离层能很快地液化从而让针体部分实现快速断裂。但是研究者选用的快速分离材料要求的温度是14-16摄氏度（详细见论文相应部分），这个要求在疫苗接种实践中显然难以实现，这个设计也导致微针成品的质量容易受到温度的影响。从实验室研究的角度来看，采用这样的技术方案无可厚非，能达到最终的研究目的即可。但如果最终目的是需要上市申报的微针疫苗贴，必须采用可靠的工艺和合法合规的材料来实现，使用任何不被药典收录的材料，都将会给药品申报带来巨大的法规方面的困难。
必赢采用专利技术，完全使用药典内材料，只需几秒的贴敷时间，即可实现微针药物在皮内快速释放，几乎是贴上即可移除。具体参见视频展示。我们能够看到贴敷之前显微镜可见染色针体整齐排列无缺损，贴敷好以后立即揭掉，我们看到揭下来的残贴上染色针尖都不见了（此处我们以同样具有角质层的树叶来代替皮肤）。在显微镜下观察树叶表面，发现每个刺入孔内都有染色的药物。
二、工艺问题
从图3可以看到，聂广军课题组团队开发的微针由三层材料构成，这也就意味着微针的生产过程会使用三种溶液进行制膜，所使用的材料是否满足法规要求不谈，这样的工艺会导致生产效率较为低下，药品质量控制难度大，生产过程中和后续物流存储过程药品质量风险大。 从视频可以清晰的看到，必赢的微针由两层构成，分别是染色的针体部分以及无色的基膜部分。青澜的第一个优势，是能做到在室温下，贴敷几秒即可实现药物针尖的向皮内递送。第二个优势在于，青澜微针产品的生产过程只有两种溶液，分别是针尖液和基膜液，制膜过程只需要两步。更难能可贵的是，视频中的样品并非实验室制作，而是由必赢的生产线制作完成。必赢一贯坚持，在尝试某个新工艺前就充分考虑到后续的可量化生产性，即研发的产品最终是否能在生产线实现稳定、高效的生产。
我们知道可溶解微针又包含两种生产工艺，分别是一体针工艺（图6）和分层针工艺（图7），前者适用于化药，后者适用于生物药。
（图6）
（图7）
聂广军课题组的研究即采用了分层针工艺。在全球微针产业化领域，能成功大规模量产一体针工艺的公司可谓寥寥，必赢已经成功具备了分层针的大规模量产能力。2021年9月23日，艾棣维欣董事长兼首席科学家王宾教授带领CMC团队考察必赢生产线（图8），就工艺的可靠性和产能情况进行了现场考察和确认。我们认为，产品的生产工艺一定要可靠，产能一定要跟上，否则研究做得再漂亮，如果最终不能实现稳定量产，那也只有学术价值而无商业价值。
（图8）
鉴于与必赢展开合作的药企越来越多，2021年10月，必赢在深圳银星科技园投资建设了专门用于微针药物研发的GMP工厂，计划2021年12月31日之前投入使用。
在产业化阶段，在实验室探索微针的工艺已经变得没有太多价值，因为即使做出结果，无法固化工艺条件，也无法具体知道实验结果是在什么样的条件下做出。必赢深圳茜坑工厂不再参与药物研发，专注生产化妆品等医美类微针产品，从物理硬件上实现化妆品和药物研发生产分离。以DNA新冠疫苗产能为例，如果有需求，必赢只需要3000平方的厂房，就可以生产出足够全球人民接种的疫苗微针贴。
三、法规问题
文献研究中使用了PEI纳米颗粒包裹的DNA质粒和非水溶性佐剂，成功地解决了透膜、溶酶体逃逸等的问题，PEI材料也是科学研究中基因药物递送常用的转染剂。然而，目前尚无一款使用PEI作为辅料的药物产品获得监管部门的批准——PEI的细胞毒性是不可回避的现实风险。但在聂广军课题组的研究中，也得到了非常明确的结论：无PEI纳米颗粒包裹的裸DNA质粒即使做成了微针，也没有成功实现细胞转染，也没有检测到有最终的抗原蛋白的表达，也就是说把裸DNA质粒做成微针贴进行贴敷，是没有免疫源性的，不能激起机体的免疫应答。
作为一个产业化企业，青澜需要做可商业化的产品。在面临法规监管方面的难题和技术难题时，我们选择了攻克技术难题，而不是挑战监管。使用一个不满足监管要求的材料，可能会导致我们的药物开发在数年内原地踏步。
艾棣维欣与NASDAQ上市公司INOVIO采用电转仪作为DNA疫苗克服透膜和溶酶体逃逸的工具，并且商品化了CELLECTRA电转仪，采用电脉冲的物理方式让DNA质粒进入细胞核。有了电转仪，必赢在与艾棣维欣合作开发过程中，始终坚持递送裸质粒，不引入不符合法规的任何材料，并在动物实验中获得了较好的抗体滴度。
四、实验数据稳定性
可溶解微针是一种药物递送方式，是一种剂型技术。2017年，FDA出了非强制性的微针类产品审评指南，并在2020年做了更新，将可溶解微针技术在审评原则上归为药械组合，虽然我们坚持认为可溶解微针本质上是创新剂型，但是对微针这样颠覆性的技术，FDA出一个审评原则总比审评方式空缺要好，至少让可溶解微针的研发和申报有了一个指导原则。欧洲、日本、中国的药监部门应该都会参考这个审评指导原则。
可溶解微针既然是一种剂型，是药物的承载和递送方式，那么可溶解微针产品的相关研究数据也应该是与药品剂型研发有同等的要求。但目前行业大多企业关于可溶解微针的可靠性数据研究数据不够稳定。部分药企的某款药物采用了微针剂型，所得到的研发数据杂乱无章，不要说拿去申报，可能自己内部都无法整理成确定的实验结果。必赢接触过的某欧洲药企，沟通完后认为必赢在微针方面确实谈了一些之前未掌握的技术信息，但是不愿意再次启动微针项目，原因是其与美国某微针企业之前开展过一次微针药物的研发合作，但是得到的研发数据很不稳定，不能作为研发结果沉淀下来，最后不得不终止项目。
微针药物研发的数据稳定性平行性，是阻碍微针行业产业化的重要因素，如果研发数据杂乱无章，那就说明这个微针技术不是稳定可靠的递送方式，这是药物这种特殊商品所不能接受的。
我们反复强调可溶解微针技术是一个结果导向的技术，微针药物研发数据的稳定性也只能靠多批次的实验结果来证明，而不能通过其他间接方式证明。
在我们与艾棣维欣合作研究的9个月中，必赢负责微针制剂学开发、微针生产工艺开发、微针质量研究等方面的工作，评价方面的所有工作由艾棣维欣完成，必赢协助贴敷方法培训。
在青澜向艾棣维欣提供的若干批次的样品，不论每个批次的抗体滴度的绝对值高低，在批次内数据平行性都非常好，不论结果好坏，都非常好下清晰的结论。当收到艾棣维欣方面的结果反馈，必赢在调整优化变量时，所得到的结果与所调整的变量刚性相关，研究逻辑随着研究的进展越发牢固。研究一路走来，逢山开路，逢水搭桥，有一些需要研究的基础问题，整个文献领域内都尚无人展开研究，我们都要去研究并找到相应的产业化解决之道。
困难道路需要结伴同行。在与艾棣维欣合作2个月时，2021年4月双方洽谈展开战略合作，由艾棣维欣战略入股必赢，并于3个月后完成交割。这是双方在技术、公司文化两方面的深度互信的结果。
基因药物递送几乎是所有药物递送里最难的，也是最麻烦的。必赢有幸在启动的第一个药物项目就是DNA新冠疫苗，在与艾棣维欣合作的9个月里，我们深入的与艾棣维欣的研发、质量、法规注册、CMC等各部门进行了多轮沟通，让我们深刻的学习了满足法规下的技术研发如何开展。
今年是必赢的药物研发年，下半年陆续有数家国内上市药企与必赢展开合作。目前必赢涉及的微针药物涵盖DNA疫苗、灭活疫苗、蛋白、多肽、水溶性化药、非水溶性化药等，我们的实验室冰箱里，存放了很多药企客户邮寄过来的各种原料药。路漫漫其修远兮，吾将上下而求索。必赢的使命就是实现可溶解微针技术的产业化。
